Tutorial Purifikasi Protein Dengan Ammonium Sulfat Lengkap

pemurnian protein

Dalam penelitian biologi yang melibatkan protein seperti enzim, antibody dan sebagainya, proses purifikasi protein atau pemurnian protein adalah hal yang krusial.

Mengapa?

Tentu saja karena pada saat Anda mengekstraksi protein dari suatu sampel, terdapat banyak pengotor yang dapat mengganggu kemurnian dan kinerja protein yang Anda inginkan. Bahkan merusaknya!

Protein umumnya dimurnikan atau lebih tepatnya diendapkan dengan metode presipitasi ionik menggunakan ammonium sulfat.

Lalu, bagaimana prinsip kerja presipitasi amonium sulfat dan bagaimana cara memurnikan protein dengan amonium sulfat?

Simaklah penjelasan Kami berikut!

 

Pengenalan Teknik Presipitasi Protein Dengan Amonium Sulfat

Perlu Anda ketahui, bahwa konsep utama dari teknik presipitasi amonium sulfat adalah mereduksi kelarutan protein dalam air dengan mekanisme yang disebut salting in dan salting out.

Bacalah penjelasan berikut untuk lebih memahami konsep!

Salting in adalah proses ionisasi protein oleh sejumlah garam amonium, dalam konteks artikel ini, yang menyebabkan kelarutan protein dalam pelarut meningkat. Karena molekul protein tertarik kearah pelarut.

presipitasi protein dengan amonium sulfat
Proses pengendapan protein dengan garam amonium sulfat: Pada dasarnya, garam amonium meningkatkan daya larut air pada protein. Namun, pada konsentrasi tinggi, molekul air sebagai pelarut terhalangi (tertarik) dan protein mengendap.

Sedangkan salting out adalah mekanisme pengendapan protein akibat berkurangnya molekul pelarut yang dibutuhkan untuk melarutkan protein, karena meningkatnya konsentrasi garam.

Okay, setelah mengerti dasar dari metode purifikasi protein dengan amonium sulfat, Kita beranjak bersama menuju pertanyaan kedua yakni “Bagaimana presipitasi amonium sulfat dilakukan?”

Melakukan Presipitasi Protein Dengan Ammonium Sulfat

Perhatikan baik-baik!

Untuk mengendapkan protein target dengan optimal, perlu dilakukan uji optimasi untuk menentukan pada konsetrasi amonium sulfat berapakah protein target Anda maksimal diendapkan.

Optimasi dilakukan dengan melakukan serangkaian uji pengendapan dengan berbagai konsentrasi amonium sulfat jenuh. Konsentrasi yang digunakan dari 20%, 30%, 40%, 50% seterusnya selama 24 jam.

Untuk menentukan konsentrasi amonium sulfat yang Anda butuhkan untuk melakukan teknik purifikasi garam ini, perhatikan section dibawah ini!

Menentukan Konsentrasi Amonium Sulfat Untuk Presipitasi (Pengendapan) Protein

Pada tabel berikut, menunjukkan berapa berat (dalam satuan gram) amonium sulfat yang harus Anda tambahkan pada seliter larutan yang mengandung protein target untuk menghasilkan konsentrasi yang Anda butuhkan.

Tabel berikut diambil dari buku Methods of Enzymology yang ditulis oleh Green dan Hughes pada tahun (1955).

presipitasi protein dengan amonium sulfat
Tabel konsentrasi amonium sulfat untuk pengendapan protein pada suhu 25 derajat celcius

Perlu Anda ketahui, pengendapan protein dengan amonium sulfat ini dilakukan pada kondisi dingin yaitu 2 hingga 4 derajat celcius. Namun, tabel diatas masih dapat Anda gunakan.

Jika Anda malas menghitung, Anda dapat menggunakan kalkulator amonium sulfat berikut untuk membantu Anda menentukan berat amonium sulfat untuk mendapatkan konsentrasi yang Anda inginkan.

Kalkulator Amonium Sulfat

Dengan kalkulator diatas, Anda dapat menentukan jumlah amonium sulfat yang Anda butuhkan berdasarkan suhu, jumlah campuran atau yang ingin Anda endapkan proteinnya dst.

 

Ingat! Selalu laksanakan prosedur ini pada suhu rendah. Protein adalah molekul termolabil. Protein akan rusak jika terpapar panas tinggi!

Langkah selanjutnya adalah melakukan dialisis.

Mengapa?

Dialisis dilakukan untuk menghilangkan pengotor non-protein dan tentu saja, garam amonium sulfat yang Anda gunakan. Garam-garam tersebut dapat menjadi inhibitor aktivitas enzim atau mengurangi kelarutan protein hingga harus dipisahkan dari protein yang Anda hendaki.

 

Okay, prosedur diatas telah dilakukan. Lalu, bagaimana mengetahui pada konsentrasi mana protein Anda mengendap maksimal?

Well.. Mari kita bahas bersama.

Metode termudah adalah dengan mengukur kuantitas protein dengan metode Bradford pada artikel ini [Doenload manual: mengukur kadar protein dengan metode bradford]. 

Lalu, agar Anda mendapatkan protein spesifik, yakni protein target yang Anda inginkan, lakukanlah uji aktivitas enzim (jika Anda menginginkan enzim) atau dengan melakukan dot blothing jika Anda ingin mengendapkan antibodi.

Setelah mendapatkan konsentrasi maksimum dari presipitasi, Anda dapat menggunakan konsentrasi tersebut sebagai konsentrasi standard dalam mengendapkan protein Anda, dan melanjutkan tahap penelitian.

Sekian artikel Purifikasi Protein Dengan Ammonium Sulfat ini. Semoga Anda lebih paham dengan cara kerja dan dasar dari pengen dapan protein ini. Jika Anda mengalami kesulitah, silahkan hubungi Kami!

Further Reading dan Bonus Ebook Protein Purification

  1. UCL. Ammonium sulphate fractionation. [serial online] http://www.ucl.ac.uk/~ucbcdab/enzpur/amso4.htm [diakses 25 April 2015]
  2. SAFC Bioscience. 2006. Protein Purification Technique-Vol. 1 Ionic Precipitation: Technical Buletin. SAFC Biosciences, Inc. [Link download pdf]
  3. Wingfield, P. 2001. Protein precipitation using ammonium sulfate. Current Protocols in Protein Science. John Wiley & Sons, Inc. http://dx.doi.org/10.1002/0471140864.psa03fs13

 

 

Leave a Reply

Your email address will not be published. Required fields are marked *